Inmunofluorescencia directa

Lo que es directo inmunofluorescencia?

La inmunofluorescencia directa (DIF) es una técnica utilizada en el laboratorio para diagnosticar enfermedades de la piel, los riñones y otros sistemas de órganos. También se le llama prueba fluorescente inmune directa o primario inmunofluorescencia

DIF implica la aplicación de anticuerpo–fluoróforo conjugado moléculas a muestras de tejido del paciente obtenidas de biopsias. Estos anticuerpos-fluoróforo conjugados objetivo anormal deposiciones de proteínas en el tejido del paciente. Cuando se expone a la luz, el fluoróforo emite su propia frecuencia de luz, vista con un microscopio. El patrón de tinción particular y el tipo de proteína anormal. declaración visto en la muestra de tejido ayuda a diagnosticar la enfermedad.

Inmunofluorescencia directa para el diagnóstico de enfermedades de la piel.

DIF es útil en el diagnóstico de sospecha autoinmune enfermedad, tejido conectivo enfermedades y vasculitis. Los patrones de tinción observados en las muestras de tejido pueden ser específicos de una entidad de la enfermedad o pueden necesitar ser interpretados con la clínica y histológico recomendaciones.

Autoinmune bulloso enfermedades

El DIF es útil para diagnosticar las siguientes enfermedades ampollosas autoinmunes:

• Pemphigus vulgaris
• Pénfigo foliáceo
• Paraneoplásico pénfigo
• Inmunoglobulina (Ig) Un pénfigo
• Penfigoide ampolloso
• Penfigoide gestacional
• Mucoso penfigoide de membrana (cicatricial penfigoide)
• Epidermólisis ampollosa adquirida

• Bulloso sistémico lupus eritematoso (LES)

• Lineal Enfermedad ampollosa IgA
• Dermatitis herpetiforme

Enfermedades del tejido conectivo

El DIF es útil para diagnosticar las siguientes enfermedades del tejido conectivo:

• Lupus eritematoso (sistémico, discoidoy subagudo cutáneo formas)

• Neonatal lupus eritematoso
• Sistémico esclerosis
• Enfermedad mixta del tejido conectivo

• Dermatomiositis

Vasculitis y otras afecciones.

DIF es útil en el diagnóstico de vasculitis cutánea y algunos otros tipos de inflamatorio enfermedad de la piel:

• Vasija pequeña (hipersensibilidad) vasculitis
• Henoch – Schönlein púrpura
• Liquen plano
• Porfiria cutánea tarda
• Algunas reacciones cutáneas adversas a las drogas.
• Fotosensibilidad erupciones

Sitio de biopsia

El sitio óptimo para tomar una biopsia de la piel depende de la enfermedad sospechada.

• Enfermedades ampollosas autoinmunes: toma una apariencia normal perilesional piel a menos de 1 cm de un bula. Como los resultados falsos negativos pueden surgir de las muestras de las extremidades inferiores, evite estos sitios si es posible.
• Enfermedades del tejido conectivo: la biopsia debe tomarse de un lesión (a menudo en áreas expuestas al sol), idealmente con más de 6 meses de edad pero aún activo. A menudo se toma una muestra adicional en un sitio protegido del sol.
• Vasculitis: para mejores resultados, tome un biopsia por punción o un profundobiopsia de afeitado de una lesión que tiene menos de 24 horas.

Por lo general, se toma otra biopsia para la hematoxilina-eosina (H&E) de rutina. histología. Tenga en cuenta que el sitio óptimo de la biopsia y el plazo requerido difieren para estos ejemplos.

• Enfermedades ampollosas autoinmunes: eliminar un entero vesícula o biopsia del borde de una ampolla.
• Vasculitis: seleccione una lesión purpúrica de menos de 72 horas de duración.

Transporte y almacenamiento de la muestra de biopsia.

Las muestras para DIF no deben colocarse en formalina, ya que esto altera las proteínas y disminuye significativamente la precisión de los resultados. Transportar la muestra al laboratorio lo antes posible. Las opciones para transportar la muestra incluyen:

• Colocado en un salinagasa empapada
• En solución salina solución
• En medios especiales (p. Ej., Michel o Zeus)
• Congelado en nitrógeno líquido (no se debe permitir que la muestra se descongele).

Cada laboratorio tiene sus propios protocolos. Las muestras en solución salina pueden producir superior sensibilidad sobre otros medios si se procesa dentro de las 24-48 horas.

¿Qué le sucede a la muestra en el laboratorio?

DIF puede llevarse a cabo en una máquina automatizada o de forma manual. El proceso implica primero hacer secciones congeladas y luego llevar a cabo inmunofluorescencia.

Preparando secciones congeladas

1. Una biopsia por punción se transporta al laboratorio en una gasa empapada con solución salina.
2. La muestra se coloca en un gel.
3. El nitrógeno líquido se usa para congelar la muestra y el gel.
4. La muestra congelada está contenida dentro del gel congelado.
5. La muestra se puede almacenar en nitrógeno líquido durante aproximadamente una semana.
6. Se cortan rodajas de 4–6 micras de espesor.

Realización de inmunofluorescencia directa.

1. Se hacen cinco o seis diapositivas; cada uno para un diferente reactivo. Se usará un portaobjetos para una tinción normal de H&E.
2. Se utiliza un bolígrafo especial para dibujar un perímetro para mantener reactivos dentro de las diapositivas.
3. Los portaobjetos se lavan.
4. Los reactivos están compuestos.
5. Los reactivos (anticuerpo-fluoróforo se conjugan con IgG, IgM, IgA, complemento proteína C3, y cuando se requiera fibrinógeno) se dejan caer sobre las diapositivas y las diapositivas se dejan durante un tiempo en la oscuridad.
6. Los portaobjetos se lavan nuevamente en solución.
7. Se colocan cubiertas de vidrio sobre las diapositivas.

Interpretación de la inmunofluorescencia directa.

Los portaobjetos de inmunofluorescencia preparados se examinan mediante un patólogo para determinar los sitios primarios de depósito inmune (si los hay), las clases de inmunoglobulina u otros depósitos inmunes y los patrones de depósito. Los patrones de tinción se pueden clasificar en cinco grupos:

• Patrón de tinción de superficie intercelular (ICS)
• Lineal zona de membrana basal (BMZ) patrón
• Patrón granular de BMZ
• Patrón Shaggy BMZ
• Vascular y otros patrones.

Ejemplos de patrones de tinción.

• Patrón de tinción del espacio intercelular (alambre de gallina), pénfigo vulgar.
• Patrón de tinción del espacio intercelular (alambre de gallina), pénfigo foliáceo.
• Deposición lineal de IgG en la zona de la membrana basal, penfigoide ampolloso.
• Deposición lineal de IgA en la zona de la membrana basal, lineal IgA ampolloso dermatosis.
• Patrón de tinción vascular en dérmico vasos para IgM.
• Deposición granular de C3 en la zona de la membrana basal

Patrones de tinción de enfermedades específicas de la piel.

Pemphigus vulgaris

• Patrón de ICS IgG (90–100%) o C3

Pénfigo foliáceo

• Patrón ICS IgG o C3

Pénfigo paraneoplásico

• Patrón de ICS débil
• Lineal o granular BMZ IgG o C3
• Algunas veces, liquenoide cambio

Pénfigo IgA

• ICS con IgA

Penfigoide ampolloso

• BMZ lineal con IgG y BMZ lineal con C3

Membrana mucosa penfigoide (penfigoide cicatricial)

• BMZ lineal con IgG, C3 e IgA

Epidermólisis ampollosa adquirida

• Lineal BMZ IgG y C3
• A veces, lineal BMZ IgA o IgM

Dermatitis herpetiforme

• BMZ granular con IgA
• A veces, BMZ C3 granular
• En raras ocasiones, BMZ IgG granular y M3

Lupus eritematoso

• Lupus eritematoso sistémico
  • BMZ granular IgG, IgM, IgA, C3
  • Moteado epidérmico núcleos patrón de IgG (10-15%)
• Lupus eritematoso discoide
  • BMZ granular IgG, IgM
  • Cuerpos citoides IgM e IgA
• Lupus eritematoso cutáneo subagudo
  • BMZ granular IgG, IgM, C3
  • Epidérmico intracitoplasmático deposición de partículas IgG
  • Cuerpos citoides IgM, IgA

Esclerosis sistemica

• Granular BMZ IgM
• Deposición moteada de núcleos epidérmicos (20%)

Enfermedad mixta del tejido conectivo

• BMZ granular (15%)
• Patrón de núcleos epidérmicos moteados IgG (46–100%)

Dermatomiositis

• IgM granular, IgG, C3
• Cuerpos citoides IgM, IgA

Reacciones liquenoides (liquen plano, reacciones a medicamentos y fotodermatosis)

• Patrón Shaggy BMZ para fibrinógeno
• Cuerpos citoides IgM, IgA

Porfiria cutánea tarda

• Vasos dérmicos: tinción gruesa continua IgG, IgA, C3
• Granular BMZ C3, IgM
• Lineal BMZ IgG, IgA

Vasculitis

• Fuertes vasos dérmicos IgM, IgG, C3, fibrinógeno

Púrpura de Henoch-Schönlein

• Fuertes vasos dérmicos IgA

¿Qué tan confiables son los resultados de inmunofluorescencia directa?

La prueba DIF es moderadamente sensible para detectar una variedad de enfermedades. La sensibilidad para DIF se aproxima al 100% para el grupo de enfermedades del pénfigo, y se ha informado que la sensibilidad es del 55-96% para el penfigoide ampolloso. Un estudio de diez pacientes con púrpura de Henoch-Schönlein y nueve con lupus eritematoso demostró pruebas positivas de DIF en todos los pacientes.

El número de resultados falsos negativos con DIF depende de la calidad de la muestra, el procesamiento de laboratorio y si el paciente ha estado en tratamiento o no. Las razones de los resultados falsos negativos incluyen:

• Un sitio incorrecto de biopsia
• Falta de epidermis en biopsia y otros errores técnicos
• Almacenamiento prolongado de la muestra antes del transporte al laboratorio.
• Photobleaching y otros errores de laboratorio.
• El paciente está en tratamiento activo inmunomodulador.